首先，研究人員對(duì)原代軟骨細(xì)胞施加 20 達(dá)因 / 平方厘米的流體FSS 并處理 2 小時(shí)，以探究異常高剪切應(yīng)力的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)SS 會(huì)顯著破壞細(xì)胞形態(tài)（表現(xiàn)為 F - 肌動(dòng)蛋白排列不規(guī)則）（圖 1A），且通過 EdU 染色發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SS 作用下的原代軟骨細(xì)胞增殖能力和活力均有所下降（圖 1B）。

接著，由于組蛋白甲基化是基因表達(dá)中最重要的表觀遺傳調(diào)控方式之一，研究人員檢測(cè)了經(jīng) FSS 處理的軟骨細(xì)胞中主要的組蛋白甲基化修飾（H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3、H3K36me3和 H3K79me3）。結(jié)果顯示 ，F(xiàn)SS 處理后 H3K4me3 顯著過表達(dá)，而 H3K27me3 表達(dá)受抑制（圖 2A ），且免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí) FSS 會(huì)使軟骨細(xì)胞中 H3K4me3 顯著上調(diào)（圖 2B）。由于 H3K4me3 與基因激活密切相關(guān)，研究進(jìn)一步探究其激活機(jī)制，結(jié)果顯示 FSS 處理后組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 Kmt2b 的 mRNA 表達(dá)及 KMT2B 蛋白水平均明顯升高（圖 2C和圖 2D），表明FSS 可能通過上調(diào) KMT2B 來激活 H3K4me3。

由于H3K4me3 激活在 OA 中起重要作用，研究人員用 MM-102 抑制其活性進(jìn)行探究。實(shí)驗(yàn)先用 20μM MM-102 預(yù)處理細(xì)胞 24 小時(shí)，再用常用于模擬軟骨細(xì)胞凋亡的SNP（500μM）孵育，結(jié)果顯示 MM-102 預(yù)處理減輕了 SNP 對(duì)軟骨細(xì)胞的凋亡刺激（圖 3A）。更重要的是，MM-102 預(yù)處理有效逆轉(zhuǎn)了 FSS 對(duì)軟骨細(xì)胞的負(fù)面影響，這為基于表觀遺傳學(xué)的 OA 治療提供了基礎(chǔ)（圖 3B 和3C）。

接下來，為了探究 FSS 誘導(dǎo) OA 的分子機(jī)制，研究人員先通過轉(zhuǎn)錄組分析確定 FSS 處理后 430 個(gè)上調(diào)基因，再經(jīng) CUT&Tag 測(cè)序發(fā)現(xiàn) 586 個(gè)受 H3K4me3 調(diào)控的基因，兩者交集篩選出 10 個(gè)基因（Capn12、Cldn1、Gpcpd1、Il13ra2、Mex3b、Nexn、Slc20a1、Srek1、Tgif1 和 Zbtb20）（圖 4A）。經(jīng) qPCR 驗(yàn)證，Zbtb20 是 FSS 處理后上調(diào)最顯著的基因（圖 4B），故被選為潛在的 H3K4me3 靶基因。CUT&Tag 驗(yàn)證顯示 Zbtb20 是 FSS 引起的 H3K4me3 激活的直接靶標(biāo)（圖 4D），且 FSS 處理后 ZBTB20 蛋白表達(dá)顯著升高（圖 4E），而 MM-102 預(yù)處理可逆轉(zhuǎn) FSS 導(dǎo)致的 ZBTB20 在 mRNA 和蛋白水平的升高（圖 4F 和 4G）。以上結(jié)果表明，ZBTB20 直接受 FSS 誘導(dǎo)的 H3K4me3 激活調(diào)控。

為進(jìn)一步研究 ZBTB20 對(duì)軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用，研究人員通過腺病毒實(shí)現(xiàn) ZBTB20 過表達(dá)。qPCR 和 Western blot 結(jié)果驗(yàn)證了原代軟骨細(xì)胞中 ZBTB20 的過表達(dá)成功（圖 5A）。結(jié)果顯示其會(huì)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡（圖 5B），抑制 Col2、Sox9 和 Acan 的 mRNA 表達(dá)（圖 5C），同時(shí)上調(diào) Col10、Cox-2 等肥大與分解代謝相關(guān)標(biāo)志物（圖 5C），以及 Mmp 家族和炎癥因子（圖 5C），表明 ZBTB20 對(duì)軟骨細(xì)胞有負(fù)面影響，會(huì)引發(fā)基質(zhì)降解和炎癥反應(yīng)。ZBTB20 過表達(dá)后，COLII 和 SOX9 的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而 COX-2 和 MMP13 的水平顯著升高（圖 5D）。鑒于 Wnt 信號(hào)通路與機(jī)械刺激響應(yīng)及關(guān)節(jié)疾病相關(guān)，且 KEGG 富集分析涉及該通路，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) ZBTB20 過表達(dá)可激活 Wnt 信號(hào)通路（β- 連環(huán)蛋白水平顯著上調(diào)）（圖 6A ）。而 Wnt/β- 連環(huán)蛋白抑制劑 LF3 處理能有效緩解 ZBTB20 的負(fù)面影響，減少細(xì)胞凋亡（圖 6B）。在過表達(dá) ZBTB20 且經(jīng) LF3 處理的軟骨細(xì)胞中，軟骨相關(guān)的正向標(biāo)志物 Sox9、Col2 和 Acan 的表達(dá)得到改善，而代表軟骨退化和炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物表達(dá)降低（圖 6C ）。Western blot 實(shí)驗(yàn)也得到了相同結(jié)果，表現(xiàn)為 LF3 處理的細(xì)胞中 COLII 和 SOX9 上調(diào)，COX-2 和 MMP13 下調(diào)（圖 6D ）。

研究發(fā)現(xiàn) FSS 會(huì)激活 Wnt 信號(hào)通路（圖 6E），為明確該通路是否參與異常 FSS 誘導(dǎo)的軟骨發(fā)病，使用 Wnt/β- 連環(huán)蛋白抑制劑 LF3 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示 LF3 預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)SNP 引起的細(xì)胞凋亡（圖 6F），且能減輕 FSS 對(duì)原代軟骨細(xì)胞的破壞，使 COLII、SOX9 水平升高，COX-2、MMP13 水平降低（圖 6G和6H）。由此推測(cè)，F(xiàn)SS 通過 KMT2B-H3K4me3-ZBTB20 介導(dǎo)的 Wnt 信號(hào)通路激活來破壞軟骨。

最后，研究人員通過 UAC 小鼠模型（模擬異常咬合誘導(dǎo)的 TMJOA）進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，結(jié)果顯示 UAC 組小鼠存在明顯的軟骨降解和退化：顯微 CT 顯示，與假手術(shù)對(duì)照組相比，UAC 組的骨密度（BMD）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁數(shù)量（Tb.N）降低，而骨小梁分離度（Tb.Sp）增加（圖 7A）；UAC 組中 Col2 和 Sox9 的 mRNA 表達(dá)水平下調(diào)，Cox-2 和 Mmp13 的 mRNA 表達(dá)水平上調(diào)（圖 7B）；H&E 和番紅 O 染色顯示UAC 小鼠 的OARSI 評(píng)分升高和軟骨細(xì)胞密度降低 （圖 7C）；免疫組化顯示，UAC 組的 COLII、SOX9 蛋白減少，COX-2、MMP13 蛋白增加（圖 7D）。同時(shí)，UAC 小鼠顳下頜關(guān)節(jié)組織中 H3K4me3 和 ZBTB20 被強(qiáng)烈激活（陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多）（圖 7D）。在異常機(jī)械力誘導(dǎo)的 TMJOA 中，H3K4me3 和 ZBTB20 的表達(dá)失調(diào)， 表明H3K4me3-ZBTB20 軸可能在剪切應(yīng)力相關(guān)的顳下頜關(guān)節(jié)發(fā)病中發(fā)揮調(diào)控作用。異常 FSS 誘導(dǎo) OA 的基于表觀遺傳學(xué)機(jī)制的整體工作模型如圖 8 所示。

總之，研究揭示了高 FSS 相關(guān)軟骨發(fā)病中的新表觀遺傳修飾，明確 H3K4me3-ZBTB20 是關(guān)鍵介導(dǎo)因子，且抑制 H3K4me3 或 Wnt 信號(hào)可部分逆轉(zhuǎn) FSS 對(duì)軟骨細(xì)胞的破壞。該研究首次發(fā)現(xiàn) OA 發(fā)病中機(jī)械應(yīng)力與表觀遺傳事件的潛在關(guān)聯(lián)，為基于表觀遺傳學(xué)的關(guān)節(jié)疾病治療方法提供了基礎(chǔ)。